RepúblicaBolivariana
De Venezuela
SecretariaSectorial
De Salud Del Poder Popular Para La Salud
CorporaciónDe
Salud Del Estado Aragua
ServicioAutónomo
Hospital Central De Maracay
CoordinaciónDe
Investigación e Docencia y Extensión
ENSAYO
SOBRE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO EHRLICHIOSIS HUMANA
Facilitador:
Dr. PhD. Richard Palma Autor: Dr. William José Hernández
Correo:
willche2906hotmail.com.
Octubre, 2017
RESUMEN
La
Ehrlichiosis humana es una enfermedad zoonótica, transmitida al hombre por la
picadura de garrapatas del perro y pocas veces del venado. E. chaffensis es el
agente causal más relacionado con la Ehrlichiosis Humana, sin embargo, la
ehrlichiosis en humanos puede ser causada por ehrlichias propias de los caninos
como E. canis y E. ewingii. En 1992, en el estado Zulia se presenta el primer
caso de Ehrlichiosis Humana, en una lactante de 17 meses de edad, en quien se
detectaron anticuerpos frente a E. chaffensis. El objetivo de esta investigación
es de reconocer la determinación de infección por Ehrlichia spp., mediante el
uso de suero y sangre en pacientes con clínica sugestiva de esta patología. Se
tomaron como predictores las técnicas de IFI y ensayo nested PCR (Reacción en
cadena de la polimerasa), usando primeros derivados de la secuencia genética
que codifica el ARN ribosomal 16S de Ehrlichia spp., que proporcionan
información de género más no de especie, debido a que se necesitan primeros de
género que pusieran detectar Ehrlichias en cualquier huésped. Ninguno estudio
ha mostrado positividad en la prueba IFI, no evidenciándose anticuerpos para
Ehrilichia spp. El ensayo nested PCR de las muestras sanguíneas no mostró
amplificación de las secuencias seleccionadas del gen del ARN ribosomal 16S en
ninguna de las muestras. Los estudios que fueron investigaron no lograron poner en evidencia la infección por
Ehrlichia spp.
Palabras Claves: Ehrlichiosis humana, Ehrilichia
chaffeensis, IFI, PCR.
Curriculum:Dr.
William Hernández: Médico Integral Comunitario UNERG– Residente de 3er año de Medicina de Emergencia.
INTRODUCCIÓN
Ehrlichia fue
identificada por primera vez en Algeria.
Históricamente la enfermedad
cobró mucha importancia durante la Guerra de Vietnam, causando la muerte de cientos de perros militares. Posteriormente se le prestó atención cuando Ehrlichia chaffeensis, un organismo muy emparentado, fue
identificado como la causa de la ehrlichiosis
monocíticahumana. La Ehrlichiosis, en su forma monocítica y
granulocítica es una enfermedad infecciosa causada por un parásito intracelular
obligado perteneciente a la familiaRickettsaceae,
Ehrlichia spp.1 La más común de
todas ellas es E.
canis que es transmitida por la garrapata que infesta con frecuencia a
los perros: Rhipicephalus
sanguineus. La Ehrlichiosis es una enfermedad zoonótica, (es conveniente
saber que la mordedura de un estado ninfal pasa desapercibida al hombre). Ehrlichia canis
es reconocida por un bajo potencial zoonótico, si bien una gran proporción de
los casos de Ehrlichiosis humana son debidas a este agente.
Con los términos ehrlichiosis y anaplasmosis se denomina a un
grupo de infecciones bacterianas transmitidas por garrapatas duras (Ixodidae) y
que afectan a hombres y animales. Son de distribución universal y están
provocadas por diferentes especies de los géneros Anaplasma y Ehrlichia.
Taxonómicamente pertenece al orden Rickettsiales y se caracterizan por ser
Gram negativas pleomorficas, y de
crecimientos intracelular obligado. De
lo antes expuesto, se describen dentro del género de Rickettsia las siguientes
especies de Ehrlichia: canis, platys, risticii, equi, phagocytophila, sennetsu,
ewingii, ondiri, bovis, ovina y
chaffeensis.2
En atención a ello, se determinó que las responsables de
enfermedades en el humano son la E. Canis, debido a que se identificó a dicho
agente en monocitos de perros de Aruba. El primer caso de Ehrlichiosis humana
fue identificado en USA, pero la primera descripción más completa en humanos
adultos se hizo años posteriores a su identificación.1En estudios
recientes se ha sugerido que la E. chaffeensis puede ser el único agente
etiológico de la Ehrlichiosis humana en EEUU. Portugal y Mali. Existen otras
especies de Ehrlichias relacionadas antigenciamente con E. canis sean fuentes
de enfermedad en el humano. En Estados Unidos de Norte América en un paciente
se reconocen signos clínicos de fiebre, dolor de cabeza, mialgia, artralgia,
nauseas, identificándose agregados bacterianos denominados mórulas de Ehrlichia
en el citoplasma de monocitos; y se confirmó la asociación con la exposición a
garrapatas.
Anteriormente, en Japón se había descrito un caso de Ehrlichiosis
monocitica humana, en un individuo quien presento sintomatología semejante.
Años posteriores a estos dos casos en Estados Unidos se aísla y caracteriza el
agente etiológico de la Ehrlichiosis monocitica humana, designándosele como E.
chaffeensis. Además se describió otra enfermedad infecciosa a la que se le
designo con el nombre de E. granulocítica humana, debido a que las mórulas se
localizaron en el citoplasma de granulocitos circulantes; en la actualidad es
clasificada taxonómicamente como
Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophila. Nuevamente en Estados Unidos, se
identifica otro agente E. ewingii, conocida en el campo veterinario, que
también puede causar E. granulocítica humana.3
El primer caso de Ehrlichiosis humana en Venezuela se demostró la presencia de anticuerpos
específicos contra E. chaffeensis, utilizando la técnica de inmunofluorescencia
Indirecta (IFI). Además, se identificó Ehrlichia semejante a E. Platys de
perro, en las células sanguíneas del paciente, mediante evaluaciones
morfológica de las mismas.2
Asimismo se publicó un trabajo de investigación titulado "Ehrlichiosis en animales y humanos en
Venezuela", donde se analizaron muestras de sangre, identificándose
el microorganismo en el citoplasma de plaquetas humanas como también en el de
caninos, donde se encontró una positividad del 45% en el grupo de humanos
estudiados que expresaron mantener estrecho contacto con animales y garrapatas.4
Hacia
finales del siglo XIX se comenzó a comprender la importancia de las garrapatas
como potenciales transmisores de enfermedades. Entre las enfermedades
transmitidas por garrapatas se encuentran aquellas producidas por especies
ehrlichiales. La Ehrlichiosis es el nombre que reciben las enfermedades
producidas por varias especies bacterianas pertenecientes a los géneros de la
familia Ehrlichiaceae. Durante décadas han sido identificados patógenos de esta
familia que producían enfermedad en diferentes especies de animales (perros,
vacas, ovejas, cabras, y caballos), así como en el hombre los perros presentan Ehrlichia equi y Ehrlichia chaffeensis, e incluso Una proporción importante
ambas a la vez, así como muchas personas que tienen una íntima relación con sus
mascotas resultan positivas en una proporción similar a Ehrlichia. Esto lleva a
la conclusión de que muchos perros
sufren Ehrlichiosis por estos agentes de gran impacto zoonótico, presentando
algunas personas sintomatología muy similar.3El cuadro clínico de la Ehrlichiosis humana se describe como inespecífico y se
caracteriza por presentar fiebre, malestar general, cefalea, mialgias, náuseas
y anorexia. También incluye la aparición
de linfoadenopatías y en un 30% de os
casos se describen erupciones cutáneas y sintomatología digestiva. A este
cuadro clínico pueden incluirse a ello
problemas neurológicos y respiratorios según sea la gravedad del proceso;
además a nivel de paraclínicos se encuentra trombocitopenia, leucopenia y
anemia. Independientemente de la especie
causante de la Ehrlichiosis, el cuadro clínico puede variar de asintomático a
fatal.5
Esta enfermedad se ha convertido en una amenaza para la salud
pública, dado su patogenia de difícil diagnóstico clínico, debido al
comportamiento epidemiológico de la enfermedad. De donde surge la inquietud, de
realizar el presente trabajo planteando la necesidad de estudiar la posibilidad
de Ehrlichiosis en personas con sintomatología o no sugestiva de la enfermedad,
expuestas a la picadura de garrapatas; y a todos aquellos individuos que
mantengan contacto estrecho con animales. Para lo que se realizara un estudio
comparativo de dos métodos diagnóstico de Ehrlichia spp en la población que
asiste al ambulatorio “nuestra señora de la luz”. Enero-abril 2012.Por esta
razón, y como parte de requerimiento del el estudio planteado nace la siguiente
interrogante ¿Cuál será el método diagnostico confiable para el diagnóstico de
ehrlichiosis, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) O IFI?
DESARROLLLO
DEL TEMA
Las
ehrlichias, son bacterias gram negativas intracelulares obligadas, polimórficas
con frecuencia esferoide u ovoides, que se establecen en células del sistema
retículo-endotelial: monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas,
produciendo mórulas intracitoplasmáticas, éstas últimas definidas como el
acumulo intracitoplasmático de las bacterias, llegando a formar una mórula más
de 40 microorganismos.1 La ehrlichiosis humana es una enfermedad
infecciosa, no contagiosa, zoonótica relacionada directamente con la
ehrlichiosis canina o pancitopenia tropical canina, enfermedad causada por una
rickettsia, llamada ehrlichia canis, transmitida por la picadura de la
garrapata café del perro, rhipicephalus sanguíneos. Ehrlichia canis fue el
primer microorganismo en ser descubierto en caninos (1935); posteriormente se
han descubierto otras especies, como: e. equí, e. bovis, neorickettsia sennetsu,
e. platys, e. chaffeensis.2En el presente se han descritos solo 5
especies que infecten al hombre anaplasma phagocytophilum, e. chaffeensis, e.
ewingii, e. canis y neorickettsia sennetsu. Su diagnóstico es reciente en los
estados unidos, donde es considerada desde 1989 por el center for disease
control and prevention (cdc) de atlanta, usa, como una enfermedad emergente. Las
enfermedades infecciosas emergentes se definen como infecciones nuevas
aparecidas en una población determinada en los últimos 30 años. La última
clasificación fue realizada en base a las similitudes de la secuencia genética
del arn ribosomal 16s entre los gen grupos de rickettsia (ehrlichia, cowdria,
anaplasma y wolbachia spp.). El grupo i es renombrado como género ehrlichia
integrado por e. canis, e. chaffeensis, e. muris, e. ewingii, y cowdria
ruminantium.3El grupo ii es renombrado como género anaplasma, el
cual está integrado por: e. equi, e. phagocytophilum, ehrlichiosis
granulocítica humana y e. platys, la cual infecta plaquetas. El grupo iii
renombrado género neorickettsia conformado por n. sennetsu, e. risticii, agente
(sf agent) aislado de la aleta de s. falcatus (un pez parásito) en Japón y
neorickettsia helminthoeca.4Hasta 1991 se creía que la especie que
afectaba al hombre era la ehrlichia monocítica del perro debido a que los
pacientes presentaban anticuerpos frente a este agente. A partir del primer
aislamiento (cultivo celular dh82 canino) se obtuvo la secuencia completa del
gen 16s ribosomal, y se demostró que se trataba de una nueva especie de ehrlichia
que también parasitaba a los monocitos, y se denominó ehrlichiachaffeensis. A
principios de 2009, se reportaron algunos casos de pacientes provenientes de Minnesota
y Wisconsin con síntomas similares a los presentados por aquellos infectados
por e. chaffeensis, pero la observación de frotis de sangre reveló inclusiones
citoplasmáticas exclusivamente en los granulocitos circulantes.5Los
estudios mediante la técnica reacción en cadena de la polimerasa de las
muestras de estos pacientes, revelaron la presencia de ehrlichia spp.,
estrechamente relacionada a e. equi, pero completamente diferente de la especie
e. chaffeensis. En el año 2014, una tercera especie fue identificada por chen y
col. como causante de ehrlichiosis; esta especie provoca cuadros más severos,
con mayor mortalidad que las anteriores. Esta especie se caracteriza por
infectar los granulocitos, preferentemente los neutrófilos y produce la
enfermedad conocida como ehrlichiosis granulocítica humana (ecg). a esta
especie se le denominó e. phagocytophila. En américa del sur, a fines de la
década de los 90, chile y argentina reportan casos positivos por serología.6EnVenezuela,
en 1992, árraga y col. Demuestran el primer caso de ehrlichiosis humana, en una
lactante de 17 meses de edad, en quien se detectaron anticuerpos frente a e.
chaffeensis. a partir de entonces se comienzan a procesar, en la unidad de
investigaciones clínicas de la facultad de ciencias veterinaria de la universidad
del Zulia, muestras de sangre de pacientes con síntomas sugestivos de
ehrlichiosis, en número mayor a 400 hasta agosto de 1997. En caracas, Maracaibo,
valencia, área metropolitana de Maracay y otras ciudades importantes, la
opinión general de los veterinarios es que existe una estrecha relación entre
la frecuencia de ehrlichiosis en animales (especialmente caballos y perros) y
la presencia de esta enfermedad en humanos. Los trabajos realizados parecen
indicar un aumento considerable de la presencia de ehrlichiosis humana en los
últimos años.11La enfermedad en humanos se presenta como un cuadro
agudo que aparece dos semanas después de la picadura de garrapata y se
caracteriza por fiebre, mialgia y cefalea. el cuadro febril de la ehrlichiosis
es similar a la producida por la fiebre manchada de las montañas rocosas, con
la excepción de que en la ehrlichiosis se encuentra la mórula y en esta última
está ausente y que la serología para r. rickettsia resulta negativa. el signo
cardinal de la infección es fiebre mayor de 38°c, que se incrementa rápidamente
en uno o dos días a 40°c o más, con poca respuesta a los antipiréticos
convencionales, acompañada por cefalea de leve a severa intensidad, astenia,
fatiga, mialgias, artralgias, escalofríos, sudoración profusa y manifestaciones
gastrointestinales como náuseas, vómitos y anorexia. los síntomas respiratorios
son comunes e incluyen: faringitis, coriza y disnea, debido a neumonía
intersticial. Las manifestaciones hemorrágicas se identifican por petequias y
equimosis en piel y mucosas. Algunos sangramientos se manifiestan como
hemorragia gastrointestinal, epistaxis y coagulación intravascular diseminada
(cid).7En casos severos, linfoadenopatías, hepatomegalia y esplenomegalia,
pueden ser observadas .Con respecto a los métodos diagnósticos se encuentran el
examen microscópico directo, realizado mediante identificación de las mórulas
en los leucocitos circulantes en frotis de capa blanca. Esto se define como
extendidos de sangre donde se concentran plaquetas, leucocitos y la porción
superior de la capa roja.8Cuando una porción de sangre es
centrifugada a 11.000 rpm. Los colorantes utilizados para la observación del
microorganismo son: diffquik o giemsa. Es una técnica sencilla, económica y a
la disposición de todos los laboratorios. en aproximadamente el 4% de los casos
durante la fase aguda de la enfermedad, se puede demostrar microscópicamente
la, mórula intracitoplásmática. las mórulas también pueden ser demostradas por
inmunohistoquímica, en tejidos obtenidos por biopsia y autopsia .9Las
técnicas serológicas y, en especial, la inmunofluorescencia indirecta (ifi) son
las más empleadas en el mundo para diagnosticar esta enfermedad. Con ifi se
demuestran anticuerpos contra el agente causal. LasIgG tardan en aparecer entre
14 y 21 días después de la infección, por lo que en fase aguda, se pueden
encontrar títulos por debajo del umbral de positividad. Para confirmar que la
sintomatología descrita es debida a una infección por ehrlichia se deben tomar
2 muestras de suero: agudo y convaleciente (15-30 días después de la primera
toma). Con ifi se demuestra seroconversión (de negativa pasa a >1/64) o
incremento de los títulos. en el caso de e. chaffeensis, títulos únicos de IgG>
128 son positivos. se ha demostrado, que en muchos pacientes, hay un incremento
de IgM e IgG para la segunda semana de la infección. Sin embargo, ya en los
primeros 15 días de la infección el paciente tiene un aumento de los títulos IgG.
Altos títulos han sido observados por largo tiempo, como dos años después de la
enfermedad aguda. La desventaja de la técnica ifi es que existen reacciones
cruzadas entre especies del mismo grupo y en menor grado entre especies de
grupos diferentes. los anticuerpos reactivos a una especie de ehrlichia pueden
presentar una reacción cruzada con otras especies de ehrlichia. Ejemplo: e.
canis con e. chaffeensis; e. equi con hge; e. ewingii con e. chaffeensis; e.
risticii, con n. sennetsu y vhe con e. chaffeensis. la reacción cruzada entre
diferentes especies, hace el diagnóstico un reto y puede ser ayudado por la
información epidemiológica y/o la aplicación de pruebas moleculares . el
aislamiento directo mediante el cultivo representa la prueba diagnóstica de
elección para el diagnóstico confirmatorio, pero es también la más dificultosa,
tanto por la complejidad del procedimiento como por el tiempo que consume; se
necesitan entre 14 a 34 días para obtener resultados positivos, por lo que no
es un método conveniente .10El diagnóstico molecular que consiste en
la amplificación del ADNEhrlichia mediante el ensayo reacción en cadena de la
polimerasa (pcr) es el método más sofisticado usado para la detección de la
infección. Este ensayo fue aprobado por el cdc y luego fue implementándose en
algunos laboratorios de estados unidos, así como en un número creciente de
laboratorios de investigación y comerciales. en el ensayo de pcr, la
sensibilidad y especificidad pueden variar entre ensayos individuales. En
personas infectadas con e chaffeensis el ADNEhrlichia ha sido detectado por
ensayo pcr de pacientes febriles, no tratados, en un tiempo tan prolongado como
7 semanas desde el inicio la enfermedad. el ensayo pcr modificado conocido como
pcr anidada o nested pcr, ha demostrado ser más sensible que la pcr estándar. Los
prikasmera castro-morales y Arocha mer utilizados provienen de la secuencia
genética que codifica el arn ribosomal 16s de ehrlichia, elemento utilizado a
su vez para la clasificación del microorganismo.11El gen blanco
ideal para la amplificación en el ensayo pcr es el arn ribosómico 16s debido a
que exhibe altos niveles de conservación estructural y bajos niveles de
secuencias divergentes menores de 0,5%, lo que lo coloca como el método ideal
para la clasificación del organismo, sus diferentes especies y la determinación
de la relación filogenética de la bacteria .Debido a la localización geográfica
del estado Zulia, con amplias áreas boscosas y selváticas, idóneas para la
supervivencia de las garrapatas; los estudios serológicos, con resultados
positivos en perros, la evidencia de anticuerpos contra especies de ehrlichia
en muestras de pacientes con manifestaciones asociadas a la enfermedad, así
como la observación de mórulas en sangre periférica en pacientes con sospecha
clínica de ehrlichiosis humana, se hace necesario confirmar la presencia de
infección por ehrlichia spp. En dichos pacientes mediante métodos de
diagnósticos serológicos y moleculares y de esta manera se evitará que dichos
cuadros clínicos sean diagnosticados como síndromes febriles prolongados de
etiología desconocida.9, 11El objetivo general de este trabajo es
investigar la presencia de infección por ehrlichia spp., en pacientes con
sospecha clínica de ehrlichiosis humana.
CONCLUSIONES
Los estudios obtenidos han demostrado la
evidencia de infección por Ehrlichia Humana en los pacientes con síntomas y
signos, ya que a través de pruebas serológicas no se evidenciaron anticuerpos contra
Ehrlichia y en las pruebas moleculares no hubo amplificación de la secuencia
genética. Los datos obtenidos permiten descartar la enfermedad por este agente,
pero no por otro, se logra inducir al descubierto por Arraga y colaboradores en
el estado Zulia, aún no clasificado por el CDC. A la luz de la información
obtenida en este trabajo se hace necesario realizar estudios
multidisciplinarios que involucren a especialistas en diagnóstico molecular,
infectólogos, epidemiólogos, médicos generales y médicos veterinarios, entre
otros, con el objeto de precisar la real magnitud e importancia de estos
agentes en nuestro país, por agentes infecciosos que son considerados como
emergentes a nivel mundial.
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